Teknologi Editing Genom “CRISPR Cas9” Pada Tanaman
Teknologi rekayasa genetika sudah dikenal oleh para Ilmuan sejak Tahun 1970, ketika para peneliti melakukan dan berhasil menggunakan tikus sebagai objek trasngenetik, meskipun teknologi ini sudah sangat modern di masa itu namun masih memiliki keterbatasan yaitu target tidak dapat dilakukan pada genom dengan tepat. Para ilmuan terus mengembangkan teknologi dengan target gen yang berbeda. Sistem penargetan gen pertama, dilakukan oleh Porteus & Carrol (2005) perakitan tersebut dinamakan zinc finger nucleases (ZFNs), yaitu enzim restriksi buatan yang dihasilkan dengan menggabungkan domain pengikat DNA Zinc finger nucleases ke domain pembelahan DNA. Pengenalan sekuen secara spesifik pada DNA dan penyisipan target ke dalam genom dapat dilakukan dengan baik. Pada tahun 2010, dikembangkan menggunakan transcription activator-like effector nucleases (TALENs) yaitu enzim restriksi yang direkayasa untuk memotong urutan DNA tertentu. Tahun 2012, ilmuan menemukan bahwa bakteri Streptococcus pyogenes dapat digunakan untuk teknologi rekayasa genetika, karena sistem ini terdiri dari CRISPR RNA (Clustered regulator interspaced short palindromic repeat) yang bertindak sebagai pemandu dan enzim Cas9 bekerja sebagai endonuklease dan memungkinkan pemutusan untai ganda (double-strand break / DSB) (Kozovska et al. 2021). Y. Ishino et al (2018) dalam tulisannya juga mengatakan bahwa CRISPR pertama kali dideteksi pada Escherichia coli, selama analisis gen yang diamati untuk konversi isozim alkali fosfatase. Pada penelitian terbesut, hampir tidak mungkin untuk memprediksi fungsi biologis dari urutan berulang yang tidak biasa terjadi dan urutan DNA tersebut masih sangat dipertanyakan (Gambar 1). Kemudian pada tahun 1993, CRISPRs pertama kalinya diamati di archaea, khususnya di Haloferax mediterania dan selanjutnya terdeteksi dalam jumlah genom bakteri dan archaeal yang terus meningkat hingga awal 2000-an, penemuan kesamaan urutan DNA antara daerah spacer CRISPR dan urutan bakteriofag, virus archaeal, dan plasmid akhirnya menjelaskan fungsi CRISPR sebagai sistem kekebalan.
Penelitian terus dilakukan hingga beberapa gen yang sebelumnya diusulkan untuk mengkodekan protein perbaikan DNA khusus untuk archaea hipertermofilik diidentifikasi dan ternyata berkaitan erat dengan CRISPR yang berasosiasi dengan gen Cas, dengan demikian mengarahkan bahwa protein CRISPR dan Cas (produk gen) sebenarnya bekerja sama dan membentuk sistem kekebalan untuk melindungi sel prokariotik terhadap virus dan plasmid yang menyerang dengan sistem interferensi RNA eukariotik (RNAi) (Ishino et al. 2018). Perbedaan CRISPR dibandingkan dengan teknologi editing gen sebelumnya adalah pada penggunaan urutan RNA pendek yang berfungsi sebagai elemen penentu spesifisitas untuk DSB. CRISPR lebih sederhana dan hanya membutuhkan RNA sebagai pemandu tunggal (sgRNA) dan bukan rekayasa nuclease dengan membutuhkan waktu panjang (Kozovska et al. 2021). Teknologi terbaru dalam dunia pengeditan genom dengan menggunakan NgAgo (Natronobacterium gregoryi Argonaute) yang dapat diterapkan untuk mengedit gen dalam sel manusia dengan endonuklease NgAgo yang dimediasi oleh DNA (Tabel 1). Pada beberapa penitian gDNA/NgAgo menyebabkan knockdown gen yang menghasilkan fenotipe abnormal pada ikan zebra, tetapi tidak ada mutasi gen yang dapat dideteksi (Xuan et al. 2017).
Gambar 1. Bentuk Struktur CRISPR (Ishino et
al. 2018)
Tabel 1. Perbandingan
Alat Rekayasa Genetika ZNFs, TALENs,
CRISPR, NgAgo (Xuan et al. 2017)
Cas9
Archaeal merupakan organisme termofilik dan hipertermofilik, selain itu terdapat Aquifex aeolicusdan Termotoga maritim yang memiliki CRISPR lebih banyak dan lebih besar daripada organisme mesofilik. Pengamatan ini pertama kali menyarankan bahwa fungsi CRISPR mungkin terkait dengan adaptasi organisme terhadap suhu tinggi. Endonuklease Cas9 adalah endonuklease DNA multi-domain dan multifungsi. Nuklease ini memiliki semua komponen yang diperlukan untuk mengikat gRNA, ikatan ini selanjutnya memungkinkan Cas9 untuk memotong lokus genom tertentu dari banyak lokus, kemudian mengikat DNA target dengan adanya gRNA, asalkan target berada di hulu (5’) dari PAM, selanjutnya membelah DNA Target, yang menghasilkan DSB.
Protein Cas banyak terlibat dalam berbagai tahap kekebalan CRISPR dan menunjukkan berbagai aktivitas manipulasi asam nukleat seperti nuklease, helikase, dan polymerase. Dalam tulisanya, Kozovska et al. (2021) metode CRISPR/Cas9 adalah sistem tiga komponen yang terdiri dari endonuklease (Cas9) dan dua RNA kecil / CRISPR RNA (crRNA) yang merupakan elemen penargetan urutan secara spesifik dan trans-activating crRNA (tracrRNA) yang menghubungkan Cas9 dengan crRNA. Ishino et al. (2018) mengatakan bahwa, seluruh jenis sistem CRISPR-Cas terbentuk secara kompleks mewakili tahap adaptasi yang diperlukan untuk penyisipan spacer baru ke dalam susunan CRISPR dan disimpan dalam genom. Selama tahap ekspresi, lokus CRISPR ditranskripsi menjadi pracrRNA yang diproses oleh endonuklease Cas spesifik ke dalam bentuk crRNA (Crispr RNA). Selama tahap interferensi crRNA diikat oleh endonuklease efektor Cas secara kompleks dan beradaptasi serta membelah DNA atau RNA target dengan cara yang bergantung pada urutan. Kondisi yang sama dapat terjadi tidak seperti pada tahap adaptasi, enzim Cas yang terlibat dalam tahap ekspresi dan interferensi bervariasi dari satu jenis CRISPR-Cas terhadap yang lain, namun enzim yang sama dapat berpartisipasi terhadap kedua tahap kekebalan tersebut (Gambar 2).
Gambar 2. Proses Sistem kekebalan CRISPR CAS
(Ishino et al. 2018)
Single Guide RNA (sgRNA) atau guide RNA (gRNA)
Cas9 diarahkan ke lokasi target oleh dua RNA: crRNA, mengenali dan mencocokan urutan 20 nukleotida dalam genom yang ditargetkan, sehingga menentukan target Cas9 dan tracrRNA, kemudian menghubungkan crRNA ke Cas9 dan memfasilitasi pematangan crRNA dari precrRNA. Kedua RNA ini (crRNA dan tracrRNA) digabungkan menjadi satu molekul yang disebut sgRNA atau gRNA. SgRNA berisi urutan target 20-nukleotida yang mengarah pada Cas9 ke lokus genom tertentu dan urutan yang diperlukan untuk pengikatan Cas9. Menurut Zhang et al. (2014) juga mengatakan dalam tulisannya bahwa crRNA matang akan digabungkan dengan transactivating crRNA (tracr-RNA) untuk membentuk kompleks tracrRNA:crRNA yang memandu Cas9 ke target. TracrRNA melengkapi crRNA dan berkontribusi pada pematangan crRNA, kemudian setelah mengikat target, crRNA pencocokan untai tunggal DNA dan untai yang berlawanan dibelah, masing-masing oleh nuklease HNH. Nuklease seperti RuvC dari Cas9, menghasilkan DSB pada target. Pembelahan DNA yang dimediasi CRISPR / Cas9 membutuhkan crRNA yang cocok dengan urutan target dan PAM 3 nt yang terletak di hilir urutan target (Skema 1).
Skema 1. Pembelahan DNA yang dimediasi CRISPR / Cas9
(Zhang et al. 2014)
Protospacer Adjacent Motif (PAM)
PAM adalah urutan pendek yang terletak pada untai DNA target, yang diperlukan untuk aktivitas endonuklease Cas9. Urutan pendek ini sangat penting karena dengan tidak adanya urutan pendek ini, maka urutan yang sepenuhnya saling melengkapi tidak dapat dikenali. Urutan PAM untuk Streptococcus pyogenes Cas9 adalah 5’-NGG-3’ (di mana G berarti guanin dan N berarti salah satu dari empat basa DNA). Namun, lebih dari 20 homolog Cas9 tambahan telah diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Homolog ini memiliki urutan PAM yang berbeda, dan tidak bereaksi silang. Ketika memotong DNA untai ganda (dsDNA) oleh Cas9, urutan PAM perlu segera ditempatkan pada ujung 3’ yang ditargetkan oleh gRNA. Hal ini memungkinkan pembelahan urutan genom oleh Cas9 menghasilkan (Double Streng Breack) DSB yang disebabkan oleh dua domain endonuclease (Kozovska et al. 2021). Zhang et al. (2014) dalam tulisannya mengatakan urutan PAM 2 - 5 nt yang terletak tepat di ujung urutan target, selain komplementaritas urutan gRNA/target. Urutan PAM yang diidentifikasi bervariasi di antara ortolog Cas9 yang berbeda, seperti PAM “NGG” dari Streptococcus pyogenes, PAM “NGGNG dan NNAGAAW” dari Streptococcus thermophiles dan PAM “NNNNGATT” dari Neisseria meningitidis. PAM membatasi frekuensi situs yang dapat ditargetkan dalam genom misalnya, dimungkinkan untuk menemukan situs target per 8 nt yaitu PAM “NGG” dan “NAG”, sedangkan per 32 dan 256 nt untuk PAM “NGGNG” dan “NNAGAAW”.
Tabel 2. Daftar pengeditan gen CRISPR/Cas9 pada tanaman
(Liu et al. 2017)
Ishino Y, Krupovic M, Forterre P. 2018. History of
CRISPR-Cas from encounter with a mysterious repeated sequence to genome editing
technology. Journal Bacteriol, 200 (7)
Kozovska,
Z., Rajcaniova, S., Munteanu, P., Dzacovska, S., Demkova, L. 2021. CRISPR: History and perspectives to the future.
Biomedicine & Pharmacotherapy 141
Liu, X., Wu, S., Xu, J., Suin , C., Wei, J.
2017.Application of CRISPR/Cas9 in plant biology. Acta Pharmaceutica Sinica, 7
(3): 292-302
Zhang, F., Wen,
Y., Guo, X. 2014. CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and
challenges. Human Molecular Genetics, 23 (1)
Komentar
Posting Komentar